研究中心

尽管大多数应用于免疫细胞疗法的病毒载体均被设计为复制缺陷型病毒载体，但在生产中仍可能发生经缺失改造的载体与野生型病毒序列之间的同源重组，导致产生复制型慢病毒（RCL，Replication competent lentivirus）。 在免疫细胞治疗产品中含有RCL会构成临床隐患和潜在危险，甚至引发肿瘤，因此RCL是免疫细胞治疗类产品的主要安全性风险之一。

随着免疫细胞疗法的发展与商业化，中国、美国及欧洲的药品监管相关机构对于RCL的检测都出台了明确的指导原则用于慢病毒生产及应用的不同阶段监测是否存在RCL。 根据最新发布的《免疫细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》和《体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则（试行）》，免疫细胞治疗产品在确证性临床阶段以及上市前则必须进行RCL检测。

我们选用人T细胞系C8166，其为HIV-1的易感受纳细胞。该方法是将样品与C8166细胞培养21天，扩增其中可能存在的微量RCL。选用缺乏辅助蛋白编码基因的减毒HIV-1毒株作为阳性对照。然后用扩增细胞上清液再感染C8166细胞，继续培养7天后，分析检测RCL病毒蛋白或核酸的存在。检测方法包括p24gag检测、Psi-gag PCR检测、VSV-G序列检测以及PERT检测。

1.P3实验室资质
     本平台在P3级生物安全实验室中进行RCL检测。
     平台P3级生物安全实验室拥有两级屏障、双扉高压灭菌器、活毒废水的处理装置、定向气流以及高效过滤器，可以为客户提供更加广泛的菌毒株选择。
     在P3级生物安全实验室进行RCL检测可以最大程度的减少检测过程中污染情况的发生，保证整个实验流程安全、高效。
2.成熟的RCL检测体系
     本平台的检测方法包括：
（1）基于p24抗原的ELISA法；
（2）基于增强型逆转录酶活性检测的PERT检测；
（3）基于质粒间的重组产生的psi-gag序列的PCR法；
（4）以及特异性检测VSV-G包膜基因的PCR法。
      四大检测方法联用，结合病毒载体具体情况和研究情况，选择合适的检测指标，最大程度避免假阳，发现潜在风险。
3.完善的样本管理
（1）每批检测时都设置合理的阳性、阴性对照，检测方法的灵敏度和检测样本量需达到临床研究使用剂量的安全性要求，同时进行留样，必要时进行回溯检测分析。
（2）扩增培养阶段的上清样品-80保存，以免病毒为释放至上清，用于trouble shooting。
（3）考虑设置混有测试样品的阳性对照，确定测试样本是否具有抗性。阳性病毒需要使用TCID50以上的病毒浓度。